Некоторые методы контроля состояния микрофлоры тела животного
(раздел для лаборантов)
Контроль состояния микрофлоры у конкретных животных или их групп позволит своевременно корректировать нежелательные изменения важной аутохтонной части нормальной микрофлоры, исправить нарушения за счет искусственного введения полезных бактериальных представителей, например бифидобактерий или лактобактерий и т. д., и не допустить развития дисбактериоза в очень тяжелых формах.
Такой контроль осуществим, если в нужный момент провести микробиологические исследования видового состава и количественных соотношений, в первую очередь в аутохтонной строго анаэробной микрофлоре некоторых областей тела животного.
Для бактериологического исследования берут слизь со слизистых оболочек, содержимое органов или даже саму ткань органа.
Взятие материала.
* Для исследования толстого отдела кишечника могут быть использованы фекалии, собранные специально с помощью стерильных трубок—катетеров или другими способами в стерильную посуду.
* Иногда необходимо брать содержимое разных отделов желудочно-кишечного тракта или других органов. Это возможно в основном после убоя животных. Таким способом можно получить материал из тощей, 12-перстной кишок, желудка и др.
* Взятие отрезков кишечника вместе с их содержимым позволяет определять микрофлору как полости пищеварительного канала, так и стенки кишки путем приготовления соскобов, гомогенатов слизистой оболочки или стенки кишки.
* Взятие материала у животных после убоя также позволяет более полно и разносторонне определять нормальную микрофлору родовых верхних и средних дыхательных путей (трахеи, бронхов и т. д.).
Количественное исследование.
Для определения количеств разных микроорганизмов взятый тем или иным способом материал от животного используют для приготовления 9—10 десятикратных разведений его (от 10 1 до 10 10 ) в стерильном физиологическом растворе или какой-нибудь (соответствующей виду микроба) стерильной жидкой питательной среде. Затем из каждого разведения, начиная от менее к более концентрированному, высевают на соответствующие питательные среды.
Так как исследуемыми пробами являются биологические субстраты со смешанной микрофлорой, надо так подбирать среды, чтобы каждая удовлетворяла ростовые потребности искомого микробного рода или вида и одновременно ингибировала рост другой сопутствующей микрофлоры.
Поэтому, желательно, чтобы среды были селективными.
По биологической роли и значимости в нормальной микрофлоре более важна ее аутохтонная строго анаэробная часть.
Приемы ее выявления основаны на использовании соответствующих питательных сред и специальных методов анаэробного культивирования; большинство из перечисленных выше строго анаэробных микроорганизмов можно культивировать на новой, обогащенной и универсальной питательной среде № 105 А. К. Балтрашевича с соавт. (1978).
Эта среда сложного состава и поэтому может удовлетворять ростовым потребностям самой разной микрофлоры. Пропись этой среды можно найти в руководстве «Теоретические и практические основы гнотобиологии» (М.: Колос, 1983). Различные варианты этой среды (без добавления стерильной крови, с кровью, плотная, полужидкая и т. д.) позволяют выращивать очень многие облигатно анаэробные виды, в анаэростатах в газовой смеси без кислорода и вне анаэростатов, используя полужидкий вариант среды № 105 в пробирках.
Бифидобактерии тоже вырастают на этой среде, если в нее добавить 1 % лактозы.
Однако, из-за чрезвычайно большого количества не всегда доступных компонентов и сложного состава среды № 105 могут возникнуть трудности с ее изготовлением. Поэтому целесообразнее воспользоваться не менее эффективной при работе с бифидобактериями, но бо лее простой и доступной в изготовлении средой Блаурокка (Гончарова Г. И., 1968). Ее состав и приготовление: печеночный отвар — 1000 мл, агар-агар — 0,75 г , пептон — 10 г , лактоза — 10 г , цистин — 0.1 г , соль поваренная (х/ч) — 5 г . В начале готовят печеночный отвар: 500 г свежей говяжей печени нарезают мелкими кусочками, заливают 1 л дистиллированной воды и кипятят 1 ч; отстаивают и фильтруют через ватно-марлевый фильтр, доливают дистиллированной водой до первоначального объема. В этот отвар добавляют расплавленный агар-агар, пептон и цистин; устанавливают рН = 8,1—8,2 с помощью 20%-кого едкого натра и кипятят 15 мин; дают отстояться 30 мин и фильтруют. Фильтрат доводят дистиллированной водой до 1 л и добавляют в него лактозу. Затем разливают по пробиркам по 10—15 мл и стерилизуют текучим паром дробно (Блохина И. Н., Воронин Е. С. и др., 1990).'
В эти среды для придания им селективных свойств необходимо вводить соответствующие ингибирующие рост другой микрофлоры агенты.
* для выявления бактероидов — это неомицин, канамицин;
* для спирально изогнутых бактерий (например, кишечных спирохет) — спектиномицин;
* для анаэробных кокков рода Veillonella — ванкомицин.
* для выделения из смешанных популяций микрофлоры бифидобактерий и других грамположительных анаэробов к средам добавляют азид натрия.
Для определения в материале количественного содержания лактобактерий целесообразно использовать солевой агар Рогоза. Селективные свойства ему придают добавлением уксусной кислоты, создающей в этой среде рН=5,4.
Не селективной средой для лактобактерий может быть гидролизат молока с мелом: к литру пастеризованного, обезжиренного молока (рН —7,4—7,6), не содержащего примесей антибиотиков, добавляют 1 г порошка панкреатина и 5 мл хлороформа; встряхивают периодически; ставят на 72 ч в термостат при 40° С. Затем фильтруют, устанавливают рН = 7,0—7,2 и стерилизуют при 1 атм. 10 мин. Полученный гидролизат разводят водой 1 : 2, добавляют 45 г простерилизованного прогреванием порошка мела и 1,5—2% агар-агара, нагревают до расплавления агара и стерилизуют повторно в автоклаве. Перед употреблением среду скашивают. По желанию в среду можно ввести какой-либо селекционирующий агент.
Выявить и определить уровень стафилококков можно на довольно простой питательной среде — глюкозном солевом мясопептонном агаре (МПА с 10% поваренной соли и 1—2% глюкозы); энтеробактерий — на среде Эндо и других средах, прописи которых можно найти в любых руководствах по микробиологии; дрожжей и грибов — на среде Сабуро. Актиномицеты целесообразно выявлять на среде СР-1 Красильникова, состоящей из 0,5 калия фосфорнокислого двузамещенного. 0,5 г магния сернокислого, 0,5 г натрия хлористого, 1,0 г калия азотнокислого, 0,01 г железа сернокислого, 2 г кальция углекислого, 20 г крахмала, 15—20 г агар-агара и до 1 л дистиллированной воды. Все ингредиенты растворить, смешать, нагреть до расплавления агара, установить рН = 7, профильтровать, разлить по пробиркам, стерилизовать в автоклаве при 0,5 атм. 15 мин, перед посевами скашивать.
Для выявления энтероккоков желательна селективная среда (агар-М) в упрощенном варианте следующего состава: к 1 л расплавленного стерильного МПА добавить 4 г фосфорнокислого двузамещенного, растворенного в минимальном количестве стерильной дистиллированной воды 400 мг также растворенного аэида натрия; 2 г растворенной глюкозы (или готового стерильного раствора 40%-ной глюкозы — 5 мл). Все перемещать. После остывания смеси примерно До 50° С добавить в нее растворённой в стерильной дистиллированной воде ТТХ (2,3,5-трифенилтетразолий хлорид) — 100 мг. Перемешать, среду не стерилизовать, тут же разлить в стерильные чашки Петри или пробирки. Энтеро кокки растут на этой среде в виде небольших, серо-белого цвета колоний. Но чаще из-за примеси ТТХ колонии эйтерококков, приобретают темно-вишневый цвет (вся колония или,ее центр).
Споровые аэробные палочки (В. subtilis и др.) легко выявляют после прогревания исследуемого материала при 80° С в течение 30 мин. Затем высевают прогретой материал ни МПА или 1МПБ и после обычной инкубации (37° С при до ступе кислорода) наличие этих бацилл устанавливают по росту их на поверхности среды в виде пленки (на МПБ).
Установить количество коринебактерий в материалах из различных областей тела животного можно с помощью среды Бучина (выпускается в готовом виде Дагестанским институтом сухих питательных сред). Её можно обогатить добавлением 5% стерильной крови. Нейссерии выявляют на среде Бергеа с ристомицином: к 1 л расплавленного агара Хоттйнгера (менее желателен МПА) добавить 1 % мальтозы, стерильно растворенной в дистиллированной воде (можно 10 г мальтозы растворить в минимальном количестве воды и прокипятить на водяной бане), 15 мл 2%-ного раствора водного голубого (анилиновый голубой водорастворимый), раствор ристомицина из ; расчета 6,25 ед. на 1 мл среды. Смешать, не стерилизовать, разлить в стерильные чашки Петри или пробирки. Грамотрицательные кокки рода Neisseria растут в виде мелких и средних колоний голубого или сине- гр, 1|[вета. Гемофильные бактерии можно выделять на среде, представляющей собой шоколадный агар (из лошадиной крови) с бацитрацином в качестве селективного агента. .
Методы выявления условно-патогенных микроорганизмов (синегнойной палочки, протея, клебсиелл и др.). Хорошо известны или можно найти в большинстве бактериологических руководств.
(КОНЕЦ РАБОТЫ)
